多種微塑料降解菌的分離及效能研究

　　摘要：從垃圾填埋場滲濾液中分離篩選塑料降解菌并對 3 種微塑料的生物降解特性進行了研究。以聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯 3 種微塑料為唯一碳源，篩選潛在降解菌，采用形態觀察、透射電鏡觀察以及 16S rRNA 基因序列分析對菌株進行鑒定，通過測定生物量、重量損失、培養液 pH 以及 FTIR-ATR 和 SEM 分析了 3 種微塑料的生物降解特性。根據 16S rRNA 基因序列鑒定，分離的 3 株為 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.。對 3 種菌株的混合培養物進行了 50 d 的生物降解實驗，結果顯示，PE、PP、PS 三種微塑料的重量損失分別為 8.7%、 6.3%和 12.5%且 pH 顯著下降;FTIR-ATR 顯示出現了新的官能團;SEM 觀察發現微塑料表面出現侵蝕。

　　關鍵詞：微塑料，垃圾填埋場，菌株分離，生物降解，效能

　　李紅羽; 鄭永杰; 田景芝， 齊齊哈爾大學學報(自然科學版) 發表時間：2021-11-16

　　近年來，微塑料污染在世界范圍內引起了越來越多的關注，已成為一個新興的研究領域[1]。微塑料被定義為尺寸小于 5 mm 的塑料微粒[2]，由工業過程中塑料碎片以及較大塑料的破裂形成[3]。微塑料占塑料廢物的 92.4%[4]，主要包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚乳酸、聚酰胺和聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)等[5]。

　　以往的研究者大量考察了微塑料的分布、攝入、歸宿、行為、量化及其對生態的影響[6-10]，但對于微塑料清除或修復的方法缺乏深入研究，包括生物降解和塑料聚合物的利用。當前對塑料的處理方式主要是熱解和化學催化降解[11-12]。相比之下，微生物降解具有污染小、不產生二次污染等特點，是解決塑料降解問題的一種綠色環保且前景良好的方法[13]。目前塑料微生物降解的研究熱點之一是篩選高效降解菌株;同時，對菌株降解塑料機理的深入解析，將會是塑料污染生物修復技術在工程中高效、綠色、低成本應用的重要因素。 Yoshida 等[14]研究了 Ideonella sakaiensis 201-F6 對 PET 的降解，該細菌可以將 PET 作為唯一能源和碳源。Mohan 等[15]的研究表明，Pseudomonas sp.和 Bacillus sp.具有降解溴化 PS 的潛力。Paco 等[16]研究了海洋真菌 Zalerion maritimum 對 PE 顆粒不同培養時間的反應。結果表明，該真菌能夠利用 PE，并能降低 PE 微粒的質量和粒徑。這些研究表明，在自然界中存在著具有微塑料降解潛力的菌種資源。

　　垃圾填埋場微生物多樣性十分豐富[17]，是天然的塑料降解菌株富集場所。因此，本研究擬開展以下研究內容：(1)從垃圾填埋場滲濾液中分離和鑒定降解微塑料的細菌菌株;(2)研究混合菌對微塑料生物降解的影響;(3)通過測定生物量、重量損失、培養液 pH，并利用 FTIR-ATR 以及 SEM 分析聚合物中結構變化來評估細菌對微塑料的生物降解特性。

　　1 實驗部分

　　1.1 試劑與儀器

　　磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、硝酸銨、氯化鈉、七水合氯化亞鐵、七水合硫酸鋅、硫酸鎂、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉，所有試劑購買自上海阿拉丁生化科技有限公司，均為分析純試劑。 DL-CJ-1ND2 型超凈工作臺，北京哈爾儀器制造有限公司;TS-112B 型震蕩恒溫培養箱，上海善志儀器設備有限公司;臺式高速離心機，上海盧湘儀有限公司;LX-B50 L 型高壓蒸汽滅菌器，合肥華泰醫療設備有限公司;S-3400 掃描電子顯微鏡(SEM)，株式會社日立制作所;H-7650 型透射電鏡(TEM)，株式會社日立制作所;Specdrum 傅里葉變換紅外光譜，美國 PE 公司。

　　1.2 菌株的富集及分離

　　以 PE、PP 和 PS 為供試微塑料，將收集到的垃圾滲濾液樣品，用生理鹽水稀釋 1 000 倍，再將 1mL 的稀釋液加到 100mL 的以微塑料聚合物(2 g/L)作為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，120 r/min、27 ℃培養，并測定菌液在 600 nm 處的吸光度(表示為 OD600)，同時觀察菌株對塑料的降解情況。待液體培養基中菌液濃度上升并趨于穩定后，取 1mL 菌液到 100mL 新鮮培養基中進行傳代培養，每 7d 進行一次傳代，每次傳代設置 3 個重復。最后利用平板對富集液進行分離純化，得到潛在降解菌株的純培養物。

　　1.3 菌株的觀察及鑒定

　　細菌樣品固定在 2.5%戊二醛溶液 4 h，去除樣品中的雜質，并用 100 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH=7.0)沖洗樣品 3 次，每次 15min，用一系列濃度(25%, 50%, 75%, 95%)乙醇溶液脫水，每個濃度處理 20min，最終浸泡在無水乙醇中，采用 TEM 分析細菌形態。將篩選出的 3 株菌送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行 16S rRNA 基因測序，將測序結果與 NCBI 數據庫進行同源性比對分析，并下載同源性高的菌種序列信息，進一步用 MEGA-X 軟件進行系統發育分析。

　　1.4 生物降解實驗

　　將上述步驟中分離出的 3 種塑料降解菌的純培養分別接種于滅過菌的 LB 液體培養基中培養，待菌株生長至對數期后，將培養液于離心機中 8 000 r/min 離心 10 min，離心后倒去上清液，加入滅菌的生理鹽水再于離心機中 8 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液，重復兩次，最后一次加入生理鹽水分散菌體，稀釋菌液至 OD600等于 1.0 左右，以上操作均在超凈工作臺中進行。分別取活化后的 3 種菌株以及混合后的菌株各 1 mL，分別接種于含有 2 g 微塑料(PE、PP 和 PS)的 100 mL 的無機鹽培養基培養液中。以含有微塑料但未接種降解菌的無機鹽培養基做為對照，27 ℃，120 r/min 振蕩培養 50 d，每組做 3 個平行實驗，50 d 后測定菌株的生物量 OD600、重量損失以及培養液 pH，考察生物降解特性。

　　1.5 菌株降解特性的研究

　　為了便于精確測定殘留微塑料的失重，通過過濾和篩分從培養基中回收微塑料。用 75%的乙醇清洗微塑料，60 ℃烘干一夜，去除附著在塑料顆粒上的生物膜。通過使用可讀性為 0.000 1g 的分析天平來測定殘留聚合物的重量，以測定生物降解程度。微塑料的失重率按百分比計算為

　　(初始重量-重量)/初始重量×100%。生物降解過程中聚合物官能團的形成或消失可以通過 FTIR 進行監測。本研究使用配備衰減全反射率(ATR)金剛石晶體附件的 FTIR 光譜分析，回收的微塑料用無菌水沖洗 3 次，再用 75%的乙醇清洗微塑料，以 4 cm-1的分辨率和 4000~500cm -1的頻率范圍對微塑料顆粒的表面官能團進行表征。

　　經混合菌處理 50 d 后的 3 種微塑料樣品用蒸餾水洗滌 3 次，再用 75%乙醇沖洗，去除表面的細菌，使最大表面暴露出來，以便觀察。在 25mA、0.3MPa 氬氣氣氛下濺射金微塑料涂層，采用 SEM 進行監測。

　　2 結果與討論

　　2.1 菌株的分離與鑒定

　　分離得到的 3 株菌命名為 LY1，LY2，LY3 三者均能以不同微塑料聚合物作為唯一碳源生長。這一結果表明這 3 種菌株物具有降解 PE、PP 和 PS 塑料的能力。他們利用聚合物的能力可能源于他們對塑料滋生環境的適應性。

　　2.1.1 菌株的形態學觀察

　　在 LB 固體培養基中，LY1 的單菌落邊緣呈不規整白色干枯狀圓形菌落，直徑 2~3 mm;LY2 的單菌落呈黃色，表面光滑、凸起、濕潤，直徑 1 mm 左右，LY3 的單菌落呈橘黃色，表面光滑、凸起、濕潤，直徑 2~3 mm，如圖 1(a),(b),(c)所示。在透射電鏡下，LY1 的形態呈長桿狀，LY2 的形態呈短棒狀，LY3 的形態呈短桿狀，如圖 1(d),(e),(f)所示。

　　2.1.2 系統發育樹構建

　　將 3 種菌株(LY1、LY2、LY3)的 16S rRNA 基因序列進行 BLAST 同源性比較分析，選擇相似度在 99.05% 以上的 10 組同源序列制作系統發育進化樹(如圖 2)，經比對分析發現菌株 LY1、LY2、LY3 分別與 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.在同一分支上，親緣關系最近。根據上述形態學觀察以及進化樹的對比結果，菌株 LY1、LY2、LY3 被鑒定為 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.。

　　2.2 分離菌的生物降解試驗

　　在生物降解實驗中，菌株的生長曲線顯示，3 種菌對不同的微塑料表現出不同的代謝反應(如圖 3)，且混菌均在培養基中濃度更高，生長更快，因此，接下來的實驗將對 3 種菌株的混合培養物進行的生物降解特性的研究。

　　圖 4 為混合菌株在 3 種微塑料為碳源的無機鹽培養基中的生物降解實驗經過 50 d pH 的變化。微塑料的降解顯著降低了培養液的 pH，培養液的 pH 從均初始中性 7.2 變化到 6.0 左右。Gong 等 [18]認為，微生物與微塑料一起培養導致微塑料逐漸緩慢降解，改變了微塑料聚合物基體的微觀結構，并分泌了酸性副產物，這導致了培養液中 pH 降低。pH 的降低證明培養物仍然具有代謝活性微生物分泌多種胞內和胞外酶到培養基中，這些酶可能對聚合物的降解起作用。在聚合物降解過程中，復雜聚合物首先被外酶分解成短鏈或單體，外酶小到足以滲透細胞壁，通過解聚過程用作碳和能源[19]。

　　2.3 生物降解特性

　　2.3.1 微塑料聚合物的失重分析

　　失重率的測定是測定生物降解最有效的方法[20]。50 d 的降解期結束后，微塑料的質量減輕可歸因于降解菌的生物降解。將 3 種微塑料 50 d 后的失重率進行了比較，50 d 后菌株對 PE、PP 和 PS 的最大失重率為混合菌作用體系下的失重，失重率分別為 6.7%、4.3%和 8.2%，對照組(未接種降解菌)中基本無質量的變化。混合菌對微塑料質量的改變是由于混合菌共同發揮作用致使微塑料化學鍵斷裂，導致微塑料聚合物羰基和末端雙鍵指數增加[21]，使得菌體分泌的胞外酶能夠更快的啟動適應機制進行生物氧化或水解，且 PS 的失重率>PE 的失重率>PP 的失重率，這種質量損失可能是由于降解菌的基因組成，菌株可能具有相當大的聚合物降解能力，對于不同塑料降解方面存在的差異可能是代謝率和聚合物吸收機制存在差異。

　　2.3.2 微塑料聚合物的紅外光譜分析(FTIR-ATR)

　　為了估計生物降解后微塑料的結構變化，分析了微塑料紅外輻射吸收率;當微生物引入氧化基團時，非極性鍵轉化為極性鍵，導致不穩定性增加，并為微生物定居和酶斷裂提供場所[21]。3 種類型的微塑料顆粒經混合菌在無碳源培養基中培養 50 d 后，在 4 000~500 cm -1的頻率范圍內，通過 ATR 分析生物降解的 3 種微塑料顆粒的化學結構，如圖 5 所示。圖 5(a)為 PE 經不同菌株作用后的紅外輻射吸收率，在 2915.3, 2846.4 , 1 466.4, 720.6cm -1處出現特征峰[22]。2 915.3, 2 846.4 cm -1處的強帶分別對應于烷烴分子中脂肪族 C—H 鍵的不對稱和對稱振動，1 466.4 cm -1和 720.6 cm -1處的強峰分別是由于 C=C 鍵拉伸、亞甲基(—CH2)基團、芳香族(C—H)彎曲和具有 4 個碳原子的長直鏈烷烴鍵。PE 僅由碳和氫原子組成。經混合微生物作用后， PE 在 1 620.2 cm -1和 1 253.1 cm -1處均出現了新的吸收帶，可能是由于形成氨基和羥基化合物，羰基帶被胺基帶取代表明菌株在微塑料誘導的環境中有良好的代謝，也可能是 PE 的化學結構受到逐漸干擾而導致降解的證據[23]，這些發現可能是由于菌株的作用導致 PE 氧化。圖 5(b)為 PP 微塑料經不同菌株作用后官能團變化，生物降解后的 PP 微塑料在 3 416.6 cm -1處形成了一個寬而強的峰，該峰賦值于 O—H，在未接種菌株的 PP 微塑料中，1462.8 cm -1處的羰基帶(C=O)較強且拉長[24]，而在接種了菌株的 PP 微塑料中，羰基帶移到了 1 575.2 cm -1處;2 963.2~2 830.4 cm -1處的 C—H 脂肪族拉伸峰和 1 462.8 cm -1處的 C—H 脂肪族彎曲峰也有明顯的減少;峰在 1 455 cm -1處的還原被認為是 C=C 的芳香族延伸;在 998cm -1和 973 cm -1處的吸收峰的伸長率屬于 C=C 彎曲[25]。圖 5(c)為 PS 微塑料經不同菌株作用后官能團變化，觀察到的鍵振動有 2866.7~ 3 028.5 cm -1處的 C—H 鍵，1 491.1~1450.5cm -1處的 C=C 鍵[26]。在接種了混合菌株的 PS 中，可以觀察到 1 248.8 cm -1處的 C—O 和 1 349.6 cm -1處的 C—H 鍵的酚醛譜帶以及峰的縮小。不同頻率下形成的氧化產物表明聚合物被微生物降解。

　　2.3.3 微塑料聚合物的 SEM 觀察

　　如圖 6 所示，在掃描電子顯微鏡下，微塑料發生了形態學變化。與混合菌培養 50d 后，微塑料表面變得粗糙，并有侵蝕、裂紋和溝槽，如圖 6(d)~(f)，未接種降解菌的對照組圖 6(a)~(c)表面光滑。3 種微塑料的表面變化表明，混合菌能夠粘附在微塑料料聚合物表面形成菌落并造成表面損傷。在 El-Sayed 等[27]關于聚乙烯降解的研究中，SEM 分析證實了微生物在聚合物表面聚集，去除微生物后聚合物表面也發生物理坑蝕，這一結果為微塑料在微生物作用下的劣化提供了證據，并證實了微生物的降解能力[28]。利用 SEM 作為分析 工具，展示塑料表面上形成的侵蝕、空洞和孔洞，以指示定值和降解的程度。利用 SEM 評價塑料聚合物的宏觀改性，如表面劣化、孔洞的形成、裂紋等變化，是一種可靠的聚合物生物降解評價方法。

　　3 結論

　　(1)將城市垃圾填埋場的垃圾滲濾液作為降解菌來源，在以微塑料作為唯一碳源的液體培養基中馴化菌株，通過劃線分離等步驟得到 3 株菌經 16S rRNA 基因鑒定為 Bacillus sp.、Microbacterium sp.、 Chryseobacterium sp.，由于菌體生長濃度的增加以及微塑料的質量損失，說明從垃圾滲濾液中成功分離出對微塑料具有潛力的細菌。

　　(2)通過測定生物量、重量損失、培養液 pH、ATR-FTIR 以及 SEM 觀察，探究 3 種菌分別對不同微塑料的降解特性，并驗證 3 種混菌混合培養能否提高生物降解效率。實驗觀察到在單獨菌以及混合菌 50 d 的作用下，微塑料質量均有不同程度的損失并生成了新的含氧基團，但混合菌作用下的微塑料失重率最高，說明菌株的混合培養提高了微塑料的生物降解效率。

　　(3)盡管這是一項緩慢的技術，但這表明了從周圍環境中發現可降解傳統類型塑料的微生物的可能性很大。今后的研究應致力于闡明塑料降解的途徑并深入了解微生物酶在生物降解中的作用，將有利于開發新的塑料聚合物生物修復策略。