太平洋牡蠣在活品流通過程中的質(zhì)譜-肽組學(xué)分析

　　摘 要 在實(shí)驗(yàn)室模擬太平洋牡蠣保活流通過程，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-Q-TOF)分析太平洋牡蠣在活品流通過程中內(nèi)源肽的變化，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法篩選出各流通階段的多肽標(biāo)志物，以期篩選出一組評(píng)價(jià)太平洋牡蠣活品流通過程中品質(zhì)變化的新指標(biāo)。根據(jù)肽組學(xué)技術(shù)對(duì)整個(gè)活品流通階段的3個(gè)環(huán)節(jié)(清洗、暫養(yǎng)凈化以及無水保活)共7個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行內(nèi)源肽提取，使用UHPLC-Q-TOF分離鑒定，并獲得各個(gè)流通階段的肽組輪廓。通過主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，并篩選出潛在的多肽標(biāo)志物，經(jīng)過在線數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定出多肽氨基酸序列。結(jié)果表明，在清洗、暫養(yǎng)凈化以及無水保活階段分別篩選出3、10、8條潛在的多肽標(biāo)志物。以潛在的多肽標(biāo)志物DYDPVDK為例，建立可用于日常分析的基于液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的分析方法。本研究采用肽組學(xué)技術(shù)對(duì)活品太平洋牡蠣在不同流通階段的內(nèi)源肽進(jìn)行組學(xué)表征，篩選出指征不同流通階段的潛在的多肽標(biāo)志物，為活品貝類的流通過程提供檢測(cè)依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜; 太平洋牡蠣; 肽組學(xué); 多反應(yīng)監(jiān)測(cè); 活品流通; 化學(xué)計(jì)量學(xué)

　　《分析試驗(yàn)室》(月刊)1982年創(chuàng)刊，是國內(nèi)外公開發(fā)行的綜合性分析化學(xué)刊物。《分析試驗(yàn)室》是理論與實(shí)踐、學(xué)術(shù)與應(yīng)用并蓄的專業(yè)期刊。

　　1 引 言

　　牡蠣屬軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，牡蠣目，牡蠣科，是一種重要的海洋水產(chǎn)資源，其營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮嫩，深受消費(fèi)者的喜愛。隨著世界上貝類海產(chǎn)品的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，國內(nèi)外市場(chǎng)上特別是一些內(nèi)陸地區(qū)對(duì)鮮活貝類需求也越來越高。因此，需要建立與優(yōu)化活品牡蠣的生鮮供應(yīng)鏈[1～3]，完善活品牡蠣供應(yīng)鏈的前提是建立精準(zhǔn)的、針對(duì)活品牡蠣的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法。

　　隨著捕撈后流通時(shí)間的延長，活品牡蠣的體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列變化，導(dǎo)致品質(zhì)不斷下降直至死亡。在流通過程中因缺少攝食而需要消耗自身能量物質(zhì)維持生命活動(dòng)，造成脂肪、蛋白、糖原等能量物質(zhì)的下降，以及活力水平(超氧化物歧化酶、ATP等)、風(fēng)味及營養(yǎng)品質(zhì)下降。牡蠣活品在流通過程中面臨多種環(huán)境脅迫，包括饑餓、干露和溫度脅迫等，造成流通過程中其品質(zhì)變化的復(fù)雜性。目前，對(duì)活品牡蠣在流通過程中的品質(zhì)評(píng)價(jià)主要依靠傳統(tǒng)的風(fēng)味指標(biāo)、能量代謝產(chǎn)物以及生命特征等[1，3]，尚未有國家標(biāo)準(zhǔn)，難以全面反映牡蠣的整體品質(zhì)[4]。因此，需要不斷完善品質(zhì)評(píng)價(jià)體系。

　　隨著檢測(cè)技術(shù)與分析技術(shù)的進(jìn)步，尤其是高分辨質(zhì)譜(High resolution mass spectrometry，HRMS)[5]技術(shù)的成熟和相關(guān)數(shù)據(jù)處理軟件的升級(jí)，組學(xué)技術(shù)已成為品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要技術(shù)[6～9]。近年提出的食品組學(xué)技術(shù)[10] ，不僅可以解決食品基質(zhì)復(fù)雜的難題[11]，更能從整體生物學(xué)角度分析品質(zhì)[9]。肽組學(xué)是一個(gè)來源于蛋白質(zhì)組學(xué)的新興領(lǐng)域[12]，研究生物樣本中的所有內(nèi)源性多肽，可縮小蛋白組與代謝組的差距[13] 。肽組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)方法體系有許多相似之處，但在分析內(nèi)容如研究對(duì)象、解析深度等方面也存在顯著差異。總體而言，在以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的組學(xué)分析中，肽的分析難度小于完整蛋白，因此，肽作為分析目標(biāo)與蛋白相比更具吸引力。目前，蛋白組被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品品質(zhì)變化的檢測(cè)，如Bosworth等[14]對(duì)受低氧脅迫的斑馬魚的魚肉進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)6種低豐度蛋白產(chǎn)生影響，而不影響蛋白的表達(dá)模式，而肽組學(xué)技術(shù)則多被應(yīng)用于食源性活性肽結(jié)構(gòu)的鑒定，如Wu等[15]利用肽組學(xué)中的LC-MS/MS并輔以定量構(gòu)效關(guān)系對(duì)大豆蛋白源ACE抑制肽進(jìn)行了純化和表征，闡明5條三肽序列分別為IVF、LLF、LNF、LSW和 LEF; 肽組學(xué)也被用于人類疾病標(biāo)志物的篩查[12，16]。但在活品牡蠣流通過程中內(nèi)源肽是否發(fā)生變化以及結(jié)構(gòu)鑒定方面尚未見報(bào)道。

　　本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF)技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，分析篩選出各流通階段活品太平洋牡蠣潛在的多肽標(biāo)志物，并建立了可用于日常分析的基于液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的分析方法。本研究利用肽組學(xué)技術(shù)闡明太平洋牡蠣在流通階段內(nèi)源肽的變化規(guī)律，并篩選出太平洋牡蠣在活品流通過程中與品質(zhì)變化有關(guān)的多肽標(biāo)志物，以期建立一組分子水平上的評(píng)價(jià)指標(biāo)，完善活品牡蠣的品質(zhì)評(píng)價(jià)體系。

　　2 實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1 儀器與試劑

　　Nexera X2 30A高效液相色譜儀(日本島津公司); 1290高效液相色譜(美國Agilent 公司); AB SCIEX Triple TOF 5600質(zhì)譜儀、Triple QuadTM 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國SCIEX 公司); MQS50001型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

　　甲酸(質(zhì)譜級(jí))、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA) (美國Sigma公司); 乙腈(美國Fisher公司); 其它試劑均為分析純。

　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　2.2.1 樣品的采集 活品太平洋牡蠣選用山東乳山(36°49′38.66′′ N，121°42′3.84′′E)的2 齡貝[殼高(108.32± 2.5 )mm，體質(zhì)量(76.23±3.5)g]，確保每組實(shí)驗(yàn)樣品大小均一，采捕于2018年4月。太平洋牡蠣捕撈到岸后，加冰運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，立刻取出30只牡蠣作為起始點(diǎn)(編號(hào)為a組)，并對(duì)牡蠣進(jìn)行常規(guī)清洗，再次取樣(編號(hào)為b組)。清洗后，對(duì)太平洋牡蠣進(jìn)行暫養(yǎng)凈化處理24 h，進(jìn)行真空包裝，于4℃進(jìn)行保活實(shí)驗(yàn)(1～9 d)，于第1、3、5、7和9 d進(jìn)行取樣。

　　2.2.2 多肽樣品制備 按上述采樣時(shí)間準(zhǔn)時(shí)采樣，隨機(jī)采取30只牡蠣，迅速取可食部位并用液氮速凍后研磨。取20 g研磨后的粉末，95℃加熱滅酶10 min，在4℃以15000 r/min離心15 min，收集上清液，得肽粗提液。