在國內外有關復合酶解輔助乙醇提取茶多酚的研究少見報道，因此本實驗采用復合酶解技術輔助乙醇提取單樅茶中茶多酚，以茶多酚的提取率為參考指標，探求酶法輔助乙醇提取茶多酚的最佳工藝條件，為單樅茶中茶多酚的提取提供一種新的方法。

材料與方法

1材料與試劑

單樅茶，興寧市南華現代農業有限公司；復合植物水解酶（纖維素酶和果膠酶），酶活力：1500NCU/g，諾維信（中國）生物技術有限公司；福林酚、碳酸鈉均為分析純，廣州市成碩試劑有限公司。

2儀器和設備

752N型紫外線可見光光度計，上海精密科學儀器有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；PL203電子分析天平，梅特勒-托利多；SHZ-Ⅲ型循環水真空抽濾機，上海亞榮生化儀器廠。

3工藝流程

單樅茶→粉碎→過篩（60目）→酶解預處理→乙醇提取→抽濾→濾液→含量測定

4實驗方法

酶添加量的選擇：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于7個三角瓶中，在酶解pH4.8，酶解溫度50℃，酶解時間3h，料液比1︰40，乙醇質量分數70%，提取溫度70℃，提取時間1h的條件下，考察不同酶添加量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%）對單樅茶茶多酚提取率的影響。酶解pH值的選擇：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于5個三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解溫度50℃，酶解時間3h，料液比1︰40，乙醇質量分數70%，提取溫度70℃，提取時間1h的條件下，考察不同酶解pH（3.2、4.0、4.8、5.6、6.4）對茶多酚提取率的影響。酶解時間的選擇：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于5個三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解溫度50℃，酶解pH4.8，料液比1︰40，乙醇質量分數70%，提取溫度70℃，提取時間1h的條件下，考察不同酶解時間（1、2、3、4、5h）對茶多酚提取率的影響。酶解溫度的選擇：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于5個三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解pH4.8，料液比1︰40，乙醇質量分數70%，提取溫度70℃，提取時間1h的條件下，考察不同酶解溫度（30、40、50、60、70℃）對茶多酚提取率的影響。

乙醇濃度的確定：精確稱取5份同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于最優酶解條件（酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時間3h、酶解pH值4.8）預處理后，在料液比1︰40，提取溫度70℃，提取時間1h的條件下，考察不同乙醇質量分數（30%、40%、50%、60%、70%）對茶多酚提取率的影響。提取溫度的確定：精確稱取5份同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于最優酶解條件（酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時間3h、酶解pH值4.8）預處理后，在料液比1︰40，乙醇質量分數60%，提取時間1h的條件下，考察不同提取溫度（30、40、50、60、70℃）對茶多酚提取率的影響。提取時間的確定：精確稱取6份同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于最優酶解條件（酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時間3h、酶解pH值4.8）預處理后，在料液比1︰40，乙醇質量分數60%，提取溫度60℃的條件下，考察不同提取時間（15、30、45、60、75、90min）對茶多酚提取率的影響。料液比的確定：精確稱取6份同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于最優酶解條件（酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時間3h、酶解pH值4.8）預處理后，在乙醇質量分數60%，提取溫度60℃，提取時間1h的條件下，考察不同料液比（1︰10、1︰20、1︰30、1︰40、1︰50、1︰60）對茶多酚提取率的影響。

5測定方法

茶樣品水分含量的測定參照文獻[19]，茶多酚含量的測定參照文獻[20]。

結果與分析

1酶解預處理單因素實驗結果與分析

如圖1~圖4所示，茶多酚的提取率隨著酶添加量增加和酶解時間的延長呈現先增加后基本保持穩定的趨勢，一方面是由于纖維素酶和果膠酶可破壞茶葉的細胞壁與細胞間質，促使茶多酚等胞內物質快速擴散溶出，提高有效成分的提取率；另一方面是由于酶解反應完全，茶多酚充分提取出來，延長時間和增加酶添加量，對提取率的影響不大。茶多酚的提取率隨酶解溫度和pH值呈現先增加后減少的變化規律。因此，實驗選擇酶添加量的范圍為2.5%~3.5%，酶解時間為2~4h，酶解pH值為4.0~5.6，酶解溫度為40~60℃，進行下一步的正交實驗。

2酶解預處理正交設計實驗結果及分析

在單因素實驗的基礎上，按照盡量減少實驗次數和尋求設計最優的原則，選擇酶解溫度、酶解時間、酶添加量和酶解pH作為因素，每個因素各取3個水平，正交實驗方案及結果見表1。極差分析結果可以看出，對茶多酚提取率影響最大的是酶解溫度，影響最少的因素是酶解pH值，各因素影響的主次順序為：酶解溫度>酶添加量>酶解時間>酶解pH值。由k值可以得到最佳組合：A3B3C2D2，即酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時間3h、酶解pH值4.8。酶解預處理最優條件實驗結果表明最高提取率為24.76%。

3乙醇提取工藝單因素實驗結果與分析

如圖5~圖8所示，茶多酚的提取率隨乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比的變化較明顯，茶多酚的提取率隨著乙醇濃度、提取溫度、提取時間升高的變化規律是先增加后減少；料液比對茶多酚提取率的影響：當料液比為(1︰10)~(1︰40)時，茶多酚的提取率隨著乙醇溶液體積的增加而增加；當料液比為(1︰40)~(1︰60)時，茶多酚的提取率保持穩定。因此，實驗選擇料液比的范圍為1︰30~1︰50，乙醇質量分數為50%~70%，提取溫度為50~70℃，提取時間為60~90min，進行下一步的正交實驗。

4乙醇提取茶多酚工藝優化

在前期酶解預處理的優化條件下和乙醇提取茶多酚單因素實驗的基礎上，對乙醇提取茶多酚工藝進行了正交優化實驗，實驗設計與結果見表2。影響茶多酚提取率的各因素主次順序是：提取溫度>料液比>乙醇濃度>提取時間，極差分析得最佳條件組合為：A3B3C2D3。即提取溫度70℃、料液比為1︰50、乙醇質量分數60%、提取時間為1.5h。

5最佳工藝的驗證實驗

根據正交實驗中復合酶解輔助乙醇提取茶多酚最佳工藝條件進行驗證實驗：精確稱取同一批次的單樅茶葉粉末1.000g于三角瓶中，在酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解pH值4.8、酶解預處理3h后，轉移到圓底燒瓶中，在乙醇質量分數60%、提取溫度70℃、料液比為1︰50的情況下提取1.5h，測定茶多酚的提取率，2次平行，提取率取平均值為25.82%，均高于單因素實驗和正交實驗結果，表明此工藝具有一定的合理性。

6水提法與復合酶解醇提法的比較實驗

從圖9可知，與傳統水提法[21][茶水比1︰15、95℃純凈水2次浸提（第1次、第2次水量分別為總水量的8/15、7/15），每次浸提30min]相比，茶多酚提取率提高了69.87%，且酶解反應溫和高效，能保持茶葉茶多酚質構穩定，提高了單樅茶茶多酚的品質，滿足市場需求。因此，復合酶解輔助乙醇提取法是－種安全可靠的提取方法，具有很好的應用前景。

小結與討論

復合酶解輔助乙醇提取茶多酚的工藝參數為：酶解溫度60℃、酶添加量3.5%、酶解時間3h、酶解pH值4.8、乙醇質量分數60%、提取溫度70℃、料液比1︰50、提取時間1.5h，在此工藝條件下，茶多酚的提取率達25.82%。

目前，茶多酚的提取有熱水浸提法和有機溶劑萃取法，前者是在相對高溫長時條件下多次浸提茶葉中的茶多酚，存在浸提不充分、高溫長時下，茶多酚尤其是兒茶素易氧化生成茶色素，與體系中咖啡堿、蛋白質生成茶乳酪，影響茶多酚的生物活性等不足[22]；后者是由于茶葉中的親水性成分大多能在有機溶劑中溶解，難溶于水的親脂性成分，在有機溶劑中的溶解性也較大。乙醇是一種毒性小，價格便宜，來源方便，可回收反復使用的有機溶劑，具有提取率高、提取液不易發霉變質等優點[23]。與傳統水浸提法相比，酶解輔助乙醇提取法不僅具有高效溫和、節能環保等優點，而且能促進茶葉內不利及無效成分的有益轉化，改善茶湯的色、香、味、形及營養價值等綜合品質，同時茶多酚提取率比水浸提法高出了69.87%，為茶葉中茶多酚的提取提供了一種新工藝。

雖然酶解結合醇提法在單樅茶茶多酚的提取方面具有許多獨特的優勢，但其應用研究還處于實驗室階段，在實際生產中的推廣與應用時，還有很多工作要做:一是醇提茶多酚安全性評估需進一步深入探討，二是醇提茶多酚溶液中的脂溶性色素較多，給后續分離純化帶來一定的困難，三是茶多酚中醇味去除關鍵技術研究；四是放大參數及生產設備都尚須做進一步深入研究。（本文作者：謝藍華、肖南、張嘉怡、江東文、杜冰、楊公明 單位：華南農業大學食品學院）