基于AFLP分子標記的園藝風信子品種遺傳多樣性分析

　　摘 要 風信子作為春季園林景觀中的流量花卉，應用方式靈活多樣。由原種風信子(Hyacinthus orientalis) 培育而來的現代風信子品種資源極為豐富，部分園林常用品種存在同物異名或同名異物現象，本研究利用 AFLP 分子標記對風信子園藝品種進行有效分類，為新品種選育提供新思路。利用 64 對引物對 30 個常見園藝風信子品種進行AFLP分子標記測定，使用NTSYSpc2.1軟件計算其遺傳相似系數。并通過NTSYSpc2.1 軟件中的 UPGMA 法構建聚類樹狀圖。篩選出的 8 對 AFLP 引物通過 PCR 擴增獲得條帶 11 703 條，其中多態性條帶 903 3 條，多態性比率為 77.18%;所有品種的遺傳相似系數范圍在 0.7 969~0.9 167 之間，平均值為 0.8 649。以相似系數 0.8 300 為閾值，30 個風信子品種可分為兩大類群、兩個亞類、五個組群，其中， White Pearl 和 Carnegie 相似系數最大，為 0.9 167;Jan Bos 和 Atlantic (2008)相似系數最小，為 0.7 969，小組群多個品種間的遺傳系數均達到 0.9 000 以上(Sky Jacket 與 Aiolos (0.9 115)、 Purple Sensation 與 China Pink(0.9 005)、Pink Pearl 與 Blue Pearl (0.9 051))。聚類結果發現相同色系、倍性的品種幾乎聚為一類,異色系中紫色系常作為中間色與其他色系聚為一類。通過 AFLP 分子標記鑒定的現代風信子園藝品種均具有較高的遺傳多樣性水平，遺傳背景較窄，相同色系和倍性的園藝品種間親緣關系最近，因此，可選用不同花色和倍性的風信子品種作為親本進行優良新品種培育。

　　本文源自何元浩; 胡鳳榮， 分子植物育種 發表時間：2021-05-21 09:27 《分子植物育種》雜志，于2003年經國家新聞出版總署批準正式創刊，CN:46-1068/S，本刊在國內外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：新技術、新方法 、學術論壇與信息等。

　　關鍵詞 風信子; AFLP; 園藝品種; 遺傳多樣性; 親緣關系

　　風信子(Hyacinthus orientalis)，別名洋水仙、五色水仙，屬于百合科(Liliaceae)風信子屬(Hyacinthus)的多年生草本花卉(Hu et al., 2015)。風信子原產于南非與地中海地區(Van Sheepen, 1992)，1562 年從土耳其引入東歐地區后，開始進行品種選育和庭院栽培。風信子園藝栽培品種極多，世界上荷蘭最多，是其重要的外貿商品(劉燕, 2016)。作為多年生秋植球根，風信子花朵繁密素雅，是冬春季節花卉市場和園林景觀中的流量花卉。目前，國內外對風信子的研究主要集中在引種栽培(王春彥等, 2009)，花期調控(張鴿香和周麗琴, 2013)，組織培養(Roxana et al., 2018; Selay et al, 2020)等方面，關于分子標記的研究報道較少(胡鳳榮等, 2015; 賀功振等, 2017)。

　　由于外在氣候環境與內在遺傳變異的影響，僅通過花、葉、果等簡單形態學表型標記很難真實反映品種間的遺傳背景和親緣關系。以 DNA 為基礎的分子標記技術既不受環境條件的影響，也不受基因表達與否的限制，是鑒定種質資源差異性最直接有效的遺傳分析方法(張德水和陳受宜, 1998)。由荷蘭科學家 Vos 創建發展的 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)分子標記技術(Vos et al, 1995)，結合了 RFLP 與 RAPD 分子標記技術的特點，只需少量純化的基因組 DNA 便可進行限制性酶切與選擇性擴增，具有重復性好，穩定性強，分辨率高等優點，廣泛用于種質資源鑒定與遺傳多樣性分析(王姍姍等, 2019)。為深入了解園藝風信子品種間的遺傳結構和遺傳多樣性，本研究采用 AFLP 分子標記技術對 30 個風信子園藝品種的遺傳背景和親緣關系進行分析，擬揭示出風信子品種間的遺傳多樣性與親緣關系，為探究重要性狀機理和選育新品種提供分子生物學基礎。

　　1 結果與分析

　　1.1 風信子 AFLP 標記多態性分析

　　以 30 個品種樣品的 DNA 為模板進行 AFLP-PCR 擴增，對 64 對引物組合中篩選出 8 對條帶清晰，多態性較好的引物(表 1)。8 對引物共擴增產出條帶 11 703 條，其中多態性條帶 9 033 條，多態性比率為 77.18%。每對引物擴增產生條帶數在 1 377~1 583 之間，平均為 1 462.87 條。其中，引物 E5-M5 多態性比率最高，為 83.19%，引物 E5-M3 多態性比率最低，為 70.95%，8 對引物擴增產生多態性條帶比率均較高(表 2)。E5-M1 引物對 30 個品種樣品的擴增結果，所得擴增產物條帶清晰，易于分辨，表明所選的引物組合多態性較好(圖 1)。

　　1.2 風信子遺傳多樣性分析

　　使用 NTSYSpc2.1 軟件計算 30 個品種間的遺傳相似系數，并構建遺傳相似系數(GS)矩陣表(表 3)，30 個風信子品種的 GS 值 0.7 969~0.9 167 之間，平均值為 0.8 649。由 GS 矩陣表看出，30 個園藝品種中， White Pearl 與 Carnegie 品種間 GS 值最大，為 0.9 167，親緣關系最近;Jan Bos 與 Atlantic (2008)品種間 GS 值最小，為 0.7 969，親緣關系最遠。同時，Aiolos 與其他品種間的 GS 平均值最大，為 0.8 837;Jan Bos 與其他品種間的 GS 平均值最小，為 0.8 264，表明 Aiolos 與其他品種間的遺傳相似性較高，親緣關系較近; Jan Bos 與其他品種間的遺傳相似性較低，親緣關系較遠。

　　1.3 聚類分析

　　基于遺傳相似系數，使用 NTSYSpc2.1 軟件，通過 UPGMA 法對 30 個風信子樣品進行聚類圖構建(圖 2)。當 GS 值為 0.8 300 時，30 個風信子品種在遺傳聚類上被分為 A、B 兩大類群，其中，品種 Jan Bos 單獨歸為 A 類群，其他 29 個品種歸為 B 類群，B 類群可分為 C、D 兩個亞類，C 亞類可細劃分為 E、F、G 三個組群，包括 11 個品種(City of Hearlem, Fondant, Apriaot Passion, Blue Magic, White Pearl, Carnegie, Anna Liza, Minos, Atlantic (2010), Gipsy Princess, Atlantic (2008))，D 亞類可細劃分為 H、I 兩個組群，包括 18 個品種(Gipsy Queen, Anna Marie, Sky Jacket, Aiolos, Amethyst, Antarctica, Wood Stock, Pink Surprise, Blue Star, Delf Blue, Purple Sensation, China Pink, Pink Pearl, Blue Pearl, Splendid Cornelia, Ostara, Red Magic, Peter Stuyvesant)。從聚類結果可以看出，30 個風信子園藝品種間的遺傳范圍較窄，親緣關系較近。

　　2 討論

　　物種或居群的遺傳多樣性源自于自身的長期進化，其遺傳多樣性的豐富程度與其適應環境的能力呈正相關，對物種遺傳多樣性的深入研究可揭示該物種的進化歷史，為分析其進化潛力和未來命運提供一定的遺傳基礎(Pamela and Douglas, 1991; 沈浩和劉登義, 2001)。本研究通過 AFLP 分子標記技術對 30 個風信子品種展開實驗，利用篩選的 8 對引物，在 30 個品種上均能獲得條帶清晰的 AFLP 指紋圖譜，表明 AFLP 技術能穩定、有效的鑒定和區分風信子種質資源。30 個風信子品種的 AFLP 分子標記鑒定共擴增產生 11 703 條，其中多態性條帶 9 033 條，多態性比率為 77.18%，略高于賀功振等(2017)采用 12 條 RAPD 引物對 20 個風信子品種擴增所得 72.0%的多態性比率，而低于胡鳳榮等(2015)采用 12 條 ISSR 引物對 29 個風信子品種擴增所得 94.5%的多態性比率，對同一物種采用不同的分子標記方法獲得多態性存在一定差異。此外，林鴻等(2012)對 23 份鳶尾種質進行 AFLP 分析，多態位點百分率為 86.3%。張克中等(2008)采用 8 對引物對 24 份野生百合種質進行 AFLP 分子標記，所得擴增產物多態性比率為 82.3%。黃平(2012)選取 14 對 AFLP 引物對 71 個月季品種進行擴增所得多態性條帶占比 95.78%。通過對不同類型(宿根; 木本)的花卉對比可以看出，風信子品種雖然多態性略低于進化歷史悠久的鳶尾、月季，但仍保持較高的多態性。與同為球根的百合相比，多態性存在差異可能源自栽培種與野生種、居群結構、球根類型等的差異。由此可見，AFLP 分子標記能夠更為有效的的分析風信子品種間的遺傳多樣性。

　　本研究根據風信子種質材料的遺傳相似系數對 30 個風信子品種進行了聚類分析。當 GS 值為 0.8 300 時，遺傳聚類上可劃分為 2 大類群。Jan Bos 單獨構成一大類群 A，同為紅色的 Red Magic 沒有與之聚為一類可能源自于倍性的差異或品種起源不同，且Jan Bos和Atlantic (2008)品種間的相似系數最低，為0.7 969，這兩個品種花色、倍性均不相同，推測可能分別起源自親緣關系較遠的二倍體。另一大類群 B 由 29 個品種構成，其中在 GS 值為 0.8 560 時可分為 C、D 兩個亞類，C 亞類的 E 小組群中 White Pearl 與 Carnegie 品種間的相似系數最高，達到 0.9 167，兩品種同為白色系，染色體數相近，同為四倍體，可能 White Pearl 是 Carnegie 丟失了一條染色體變異而來;F 組群中的 Anna Liza 與 Minos 品種間的 GS 值也高達 0.9 039，雖然兩品種都為整倍體，但色系、倍性均不同，推測可能 Minos 是 Anna Liza 的一個染色體組加倍而來，，也可能是產生了二倍體的雌雄配子或是染色體組在加倍過程中出現了基因突變或染色體結構變異。四倍體的藍色系品種 Atlantic (2008)單獨構成 G 組群。在 D 亞類的 H 組群中，同為藍色系，染色體數目相同的四倍體品種 Blue Star 與 Delf Blue 品種間也展現出極高的遺傳相似性，說明這兩個品種親緣關系較近，遺傳差異性較小，這與胡鳳榮等(2015)的研究結果一致;該組群中多組品種間遺傳系數均較高：Sky Jacket 與 Aiolos (0.9 115)、Purple Sensation 與 China Pink (0.9 005)、Pink Pearl 與 Blue Pearl (0.9 051)。H 組群品種較多，從花色上來看，多數為紫藍，紫粉，粉藍等組合，各品種間的遺傳相似系數較小，說明親緣關系近，可能一個品種起源于另一個品種或是起源相同，只是在變異過程出現了基因變異或染色體數目或結構的變異。I 組群由 Red Magic 與 Peter Stuyvesant 兩品種組成，兩品種花色不同，倍性相同，展現出高度的相似性，推測 Red Magic 可能是 Peter Stuyvesant 丟失一條染色體產生新品種。通過聚類結果可以看出，雖然 30 個品種間存在著一定的遺傳差異，但現代風信子的園藝品種都是由原種風信子(Hyacinthus orientalis)，以及淺風信子(var.albulus)、大筒淺白風信子(var.praecox)、普羅文斯風信子(var.provincialis) 3 個變種經過不斷選育雜交而來，遺傳背景相對單一，親緣關系都較近(英國皇家園藝學會, 2000)。除同色系品種，藍色、紫色、粉色系品種間常聚為一類，這與蘇曉倩等(2019)的色差分析結果一致，各品種中花色苷種類及比例不同使花色產生的差異(陶秀花等, 2015)，也是導致聚類結果不同的原因之一。

　　風信子園林應用方式靈活多樣，是布置花壇、花鏡優良的材料。鑒于風信子品種繁多，基于 AFLP 分子標記可有效檢查各品種間同物異名或同名異物現象。本研究通過 8 對 AFLP 引物對 30 個風信子品種進行擴增產生條帶 11 703 條，多態性條帶 9 033 條，多態性比率為 77.18%，較高的多態性以及遺傳多樣性表明風信子具有較強的環境適應能力。聚類分析將 30 個品種分為與倍性和花色系相關的兩大類群，兩個亞類，五個組群。該研究結果可為風信子遺傳多樣性分析、遺傳性狀鑒定以及新品種選育提供分子水平上理論依據。

　　3 材料與方法

　　3.1 試驗材料

　　30 個風信子園藝品種樣品采集于南京林業大學園林實驗教學中心溫室(118.83°E, 32.08°N)，。風信子染色體基數為 8，二倍體為 16 條染色體、三倍體和四倍體存在非整倍體，染色體數目分別為 23~25、30~32 條染色體(表 4)。每一品種樣品采集生長良好，無病蟲害的新鮮幼嫩葉片，液氮保存。

　　3.2 基因組 DNA 的提取

　　以 30 個風信子園藝品種的葉片為材料，通過簡易 CTAB 法提取其樣品基因組 DNA (胡鳳榮, 2011)。通過 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 質量。

　　3.3 風信子 AFLP-PCR 分析

　　限制性酶切與連接：利用 EcoRI 和 MseI 內切酶構建雙酶切與連接體系，反應體系總體積為 20 μL： DNA 模板(50 ng/μL) 4 μL，Adapter 1 μL，EcoRI/MseI 2 μL，ATP(10 μmol /L) 2.5 μL，T4 Ligase 1 μL，補足 ddH2O 至 20 μL。將混合液混勻數秒，37 ℃保溫 5 h，之后 8 ℃保溫 4 h，4 ℃過夜。

　　預擴增：選擇 EcoRI (5’> GAC TGC GTA CCA ATT CA< 3’)與 MseI (5’> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3’)為預擴增引物，反應體系總體積為 25 μL：連接后的 DNA 模板 2 μL，Pre-ampmix (預擴引物) 1 μL， dNTPs (10 μmol /L) 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶(2U/μL) 0.5 μL，補足 ddH2O 至 25 μL。離心數秒,按下列參數進行 PCR 擴增：94 ℃，2 min;94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，80 s，30 個循環;最后 72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。

　　選擇性擴增：預擴產物 1:20 稀釋后作為選擴模板，選擇 EcoRI/MseI 引物組合進行選擇性擴增，反應體系總體積為 25 μL：預擴稀釋樣品 2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs (10 μmol /L) 0.5 μL，EcoRI 引物 1 μL，MseI 引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶(2U/μL) 0.5 μL，補足 ddH2O 至 25 μL。將混合液混勻離心數秒,按下列參數進行 PCR 擴增： 94 ℃，30 s，65 ℃，30s，72 ℃， 80 s 為第 1 個循環;以后每輪循環溫度遞減 0.7 ℃，擴增 12 輪;接著按 94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，80 s，擴增 23 輪;最后 72 ℃延伸 5 min， 4 ℃保存。

　　PCR 擴增反應在 Gene Amp PCR System 9600 擴增儀(Perkin Elmer, USA)上完成，內切酶與 T4 連接酶均購自 New England Biolabs (NEB) 公司，引物設計由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司完成。4%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物。

　　3.4 數據分析

　　通過測序儀電泳檢測后的原始數據 30 個樣品，8 對引物組合通過 GENESCAN 軟件進生物學分析，根據電泳的結果，在原始數據的基礎上，有帶的地方替換為 1，無帶的地方替換為 0，構成 01 數據。使用 NTSYSpc2.1 軟件計算 30 個品種的遺傳相似系數，并根據相似系數使用 UPGMA 法進行聚類分析。

　　作者貢獻

　　何元浩是本研究的實驗設計者和實驗研究的執行人，完成數據分析，論文初稿的寫作;胡鳳榮是項目的構思者及負責人，指導實驗設計、數據分析、論文寫作與修改。兩位作者都閱讀并同意最終的文本。

　　致謝

　　本研究由國家級林業科技成果推廣項目“風信子優良品種及鱗片扦插繁殖技術推廣”(2015[20]號)和江蘇高校品牌專業建設工程資助項目(PPZY2015A063)共同資助。