姜黃素調節SREBP和FAS改善非酒精性脂肪性肝病的研究

　　摘要：目的：探究姜黃素對非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的作用和可能機制。方法：18只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和姜黃素組，每組各6只。模型組和姜黃素組予以高脂高膽固醇食物10ml/kg灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃。建模成功后，姜黃素組每日給予姜黃素100mg/kg灌胃，對照組和模型組給予等量的羧甲基纖維素鈉。治療4周后，檢測大鼠血清ALT、AST、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)水平，HE染色觀察大鼠肝臟組織病理學變化，免疫組織化學法檢測大鼠肝組織固醇調節元件結合蛋白(SREBP)和脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表達情況，蛋白免疫印跡法檢測沉默調節蛋白6(Sirt6)和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白表達變化。結果：模型組ALT、AST、TG、TC、SREBP和FAS蛋白表達均高于對照組(P均<0.05);姜黃素組ALT、AST、TG、TC、SREBP和FAS蛋白表達均低于模型組(P均<0.05)。模型組Sirt6、p-AMPK蛋白表達均低于對照組(P均<0.05);姜黃素組Sirt6、p-AMPK蛋白表達均高于模型組(P均<0.05)。結論：姜黃素可以減輕大鼠NALFD的脂肪沉積和肝損傷，可能與Sirt6、p-AMPK的表達上調相關。

　　本文源自新醫學,2020,51(11):871-876.《新醫學》雜志創刊于1969年，是中華人民共和國教育部主管，中山大學主辦，中山大學附屬第三醫院承辦的綜合性醫藥衛生類月刊。2010年獲“廣東省第四屆期刊提名獎”，2012年繼續入選為中國科技論文統計源期刊(中國科技核心期刊)。

　　非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指排除長期大量飲酒和其他明確的肝臟損傷因素所引起的脂質在肝細胞中儲積為病理改變的肝臟代謝性疾病。近年來，NAFLD逐漸成為全球最常見的慢性肝病[1]。目前關于NAFLD發病機制尚不十分明確，現被公認的是“二次打擊學說”。其可能的機制有氧化應激、內質網應激、胰島素抵抗、炎癥反應以及自噬與DNA損傷等[2,3,4]。固醇調節元件結合蛋白(SREBP)和碳水化合物反應原件結合蛋白是調節肝臟脂質合成的關鍵性基因，進而參與調控肝臟脂質代謝過程[5,6]。因此，通過尋找有效藥物抑制SREBP表達，對于改善NAFLD脂質代謝紊亂至關重要。

　　姜黃素是一種多酚類物質，從植物姜黃中提取。研究發現，姜黃素具備抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗自噬、抗胰島素抵抗等作用，且對于糖尿病、COPD、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病的治療都有確切的效果。既往研究發現，姜黃素能夠通過調節SREBP，進而參與肝臟脂質代謝[7]。在NAFLD大鼠中，降脂顆粒可以通過下調肝X受體α和SREBP-1c的表達，調節脂肪酸代謝[8]。但是有關姜黃素對SREBP調節的分子機制尚不完全清楚。因此，本實驗研究通過構建NAFLD型大鼠模型，探究姜黃素對SREBP的分子調控機制。

　　材料與方法

　　一、材料

　　1.實驗動物

　　實驗選取雄性SPF級別，體質量為180～200g的SD大鼠共18只(購于錦州醫科大學動物中心)并通過動物倫理委員會批準(批號：20190816)，實驗動物飼養于濕度在30%～70%、溫度維持在25℃的動物房內并采取晝夜交替光照處理。

　　2.主要實驗藥品及試劑

　　膽固醇(萬邦實業有限公司，批號：2017031625)，姜黃素(上海瑞永生物科技有限公司)，SREBP一抗和脂肪酸合成酶(FAS)一抗抗體(武漢Proteintech)，沉默調節蛋白6(Sirt6)一抗(武漢博士德公司)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)一抗(美國CellSignalingTechnology)，β-actin一抗(江蘇碧云天公司)PVDF膜(Millipore公司)，SDS-PAGE凝膠(武漢博士德公司)，一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天公司)。

　　3.主要實驗儀器

　　純水儀器(湖南湘儀公司)，酶標儀(江蘇碧云天公司)，組織切片機(武漢賽默飛公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olmpus公司)，凝膠電泳裝置(北京六一生物科技有限公司)，顯影儀(上海西唐生物科技有限公司)，脫色搖床(上海魯碩實業有限公司)，高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)。

　　二、方法

　　1.造模及分組

　　將18只實驗大鼠隨機分為3組，每組各6只，即為對照組、模型組、姜黃素組。模型組和姜黃素組予以高脂高膽固醇食物10ml/kg灌胃，對照組給予生理鹽水10ml/kg灌胃。其中高脂高膽固醇食物的配制為60%豬油、10%膽固醇及30%玉米面加200ml食用水，熬制成糊狀，放入37℃恒溫箱內，對照組給予常規飼料飼養。3個月后隨機處死模型組和姜黃素組各1只大鼠，肝臟病理見肝脂肪細胞變性表明建模成功。姜黃素組給予姜黃素100mg/kg按每日1次給藥;對照組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃;持續給藥4周。隔夜禁食水，次日清晨予大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，稱重、解剖并左心室采血，取部分肝臟組織浸泡于4%的多聚甲醛，經脫水、石蠟包埋后行HE染色和免疫組織化學檢測。

　　2.相關指標檢測

　　按照試劑盒說明書進行大鼠血清中ALT、AST、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量測定。HE染色：4%的多聚甲醛固定大鼠肝臟組織，石蠟包埋后切片，之后行HE染色操作。免疫組織化學染色：(1)石蠟切片60℃下烘烤1h;(2)脫蠟至水，二甲苯處理3次，每次5min，無水乙醇處理3次，每次10min,95%乙醇處理2次，每次10min,ddH2O洗2次，每次5min,0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次10min;(3)消除過氧化物酶體，3%H2O2溶液孵育10min,0.01mmol/LPBS洗3次，每次5min;(4)微波抗原修復，枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)250ml置于微波爐中450W預熱5min，將組織放入緩沖液中，微波250W加熱10min，冷卻至室溫，約耗時40min，雙蒸水洗3次，每次5min,PBS洗3次，每次5min;(5)封閉，利用5%的BSA封閉1h;(6)打孔透膜，利用0.3%的TritonX-100孵育10min;(7)一抗孵育，4℃濕盒孵育SREBP和FAS抗體過夜;(8)二抗孵育;(9)二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明;(10)中性樹膠封片和顯微鏡下觀察結果。

　　蛋白免疫印跡法：(1)組織碾磨，將處理完成的各組大鼠肝臟組織取出，采用PBS清洗后并用手術剪刀剪取少許肝臟組織放置于組織碾磨管內，按照1∶5的比例加入組織裂解液后放置于組織碾磨儀中充分碾磨3～5min;(2)離心，4℃以12000rpm離心15min，取組織上清液;(3)蛋白質濃度測定，利用二辛可寧酸(BCA)法進行蛋白質濃度定量測定;(4)凝膠電泳，按照上樣量為40μg進行蛋白凝膠電泳120min;(5)轉膜，依據蛋白質marker指示進行切膠，并放置聚偏二氟乙烯(PVDF)膜進行轉膜約90min;(6)封閉，5%的脫脂牛奶封閉1～2h;(7)孵育一抗，洗脫完成，孵育對應的一抗過夜;(8)孵育二抗，室溫條件下，二抗孵育約2h;(9)顯影，將孵育完成的PVDF膜使用吐溫-20的PBS洗滌2～3次，每次5min，滴加顯影液顯影并拍照。

　　三、統計學處理

　　采用SPSS18.0進行數據分析。正態分布計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

　　結果

　　一、姜黃素對大鼠血清生化指標的影響

　　與對照組相比，模型組ALT、AST、TG和TC增高，差異均有統計學意義(P均<0.05);與模型組相比，姜黃素組ALT、AST、TG和TC均降低(P均<0.05)。

　　二、HE染色觀察大鼠肝臟組織形態學變化

　　與對照組相比，模型組肝小葉內彌漫性分布著空泡細胞，空泡大小不一，肝小葉結構尚存，邊界模糊，有淋巴細胞分布于肝臟。相比于模型組，姜黃素組的肝小葉內空泡細胞明顯減少，肝小葉結構清晰，肝臟內的空泡細胞數量最少，見圖1。

　　表1各組血清生化比較

　　圖13組肝臟組織形態學變化(HE染色，×200)

　　三、免疫組織化學法檢測大鼠肝臟組織中的SREBP和FAS表達

　　SREBP和FAS的定位都位于細胞質內：與對照組相比，模型組SREBP和FAS的表達增加;與模型組相比，姜黃素組SREBP和FAS的表達減少，見圖2。

　　四、姜黃素對大鼠肝臟Sirt6和p-AMPK表達的影響

　　3組肝臟組織Sirt6和p-AMPK蛋白表達比較差異均有統計學意義(FSirt6=12.83,PSirt6=0.001;Fp-AMPK=16.67,Pp-AMPK<0.001)，相比于對照組，模型組Sirt6和p-AMPK蛋白表達降低(P均<0.05);與模型組相比，姜黃素組Sirt6和p-AMPK蛋白表達升高(P均<0.05)，見圖3。

　　討論

　　NAFLD是以彌漫性肝細胞脂肪病變而導致的一種病理性臨床病理綜合征。NAFLD是一種進展性疾病，其發病機制尚不明確。既往研究發現胰島素抵抗、脂質代謝異常、炎性細胞因子和氧化應激所致肝細胞凋亡等因素是NAFLD發生和發展的主要原因[9]。現有研究者提出在NAFLD的“二次打擊學說”中，初次主要是胰島素抵抗所致，胰島素抵抗主要通過促使外周脂解增加和高胰島素血癥引起肝細胞脂肪蓄積，并增加了對內、外源性損害因子敏感性。二次打擊主要為反應性氧化代謝產物、脂肪細胞因子、腸應激和腸道菌群內毒素等各種損害因子誘導活動UCP-2、FAS配體等，進而使得脂肪變性的肝細胞出現炎癥、壞死等一系列病理生理學改變[10,11,12]。

　　圖肝臟和-蛋白表達

　　圖肝臟和的表達(免疫組織化學染色)

　　NAFLD是指中性脂肪在肝細胞內以脂滴或者脂質囊泡的形式在胞質中過度積累。在諸多研究中發現總膽固醇在NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎形成和發展中所起的脂毒性作用尚不完全清楚。因此，通過研究NAFLD中膽固醇合成和代謝的相關基因顯得尤為重要。SREBP屬于螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈(bHLH-ZIP)結構家族，是一種節脂質合成的轉錄因子家族，是由SREBP1a、SREBP1c、SREBP2三種亞型構成[13,14]。多項研究均指出SREBPS在NAFLD的發生發展中起重要作用。近年來諸多研究也發現姜黃素可以通過降低TG、TC改善NAFLD。研究發現，姜黃素可通過下調節SREBP和FAS表達，減少脂質在肝臟內沉積，降低脂毒性對肝臟損害，進而保護肝臟細胞，使得病情得以逆轉，從而治療NAFLD[15]。對此本研究初步研究發現，相比于模型組，通過姜黃素大鼠灌胃處理的NAFLD組SREBP和FAS的表達明顯下降，AST、ALT、TG和TC水平均明顯降低。上述結果表明，姜黃素可能通過調節SREBP和FAS，從而降低TG、TC等合成，改善NAFLD。那么姜黃素是通過何種分子機制調控SREBP表達?

　　Sirt6是Sirtuins家族成員之一，具有高度保守的NAD+依賴性的去乙酰化酶，可能通過調節內皮一氧化氮合酶而發揮抗心肌肥大的作用[16]。以往研究發現，Sirt6基因缺失是導致TG累積的主要因素，與脂肪性肝臟疾病密切相關[17]。在高脂喂養的小鼠中Sirt6的表達顯著降低，通過過表達Sirt6可以降低小鼠血液脂質含量，減少肝臟內脂肪的積累[18]。亦有研究證實，Sirt6可以通過增加AMP/ATP比例，活化AMPK信號通路，進而調控SREBP蛋白表達[19]。因此，在本實驗研究中，我們通過蛋白免疫印跡法檢測大鼠肝臟組織中Sirt6和p-AMPK蛋白表達。結果發現，相比于對照組，模型組Sirt6和p-AMPK蛋白表達均明顯降低，給予姜黃素處理可以促進Sirt6和p-AMPK蛋白表達，進而改善NAFLD。綜上所述，姜黃素可以減輕大鼠NALFD的脂肪沉積和肝損傷，可能與Sirt6、p-AMPK的表達上調相關。以上研究結果為姜黃素治療NAFLD提供了新的理論依據。

　　參考文獻：

　　[5]耿得珍,卜亞茹,焦波.潛在的代謝性疾病治療靶點——固醇調節元件結合蛋白.中國藥學雜志,2019,54(15):1205-1210.

　　[7]韓曉群,林劍國,楊婧.姜黃素對活化肝星狀細胞內脂質水平的影響及其機制.解放軍醫學雜志,2018,43(12):1019-1023.

　　[8]楊麗麗,王淼,柳濤,宋海燕,勵冬斐,鄭培永,劉平,季光.降脂顆粒對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝X受體α和固醇調節元件結合蛋白1c表達的影響.中西醫結合學報,2011,9(9):998-1004.

　　[9]肖陽,侯云鶴,尹鑫,康鳳,李樹德,楊世昆,陶建平.人參皂苷Rg1干預非酒精性脂肪肝模型大鼠肝細胞的凋亡.中國組織工程研究,2019,23(3):384-390.

　　[10]張姍姍,王來友.非酒精性脂肪性肝病藥物治療學前沿與展望.世界華人消化雜志,2019,27(2):73-79.

　　[16]黃小陽,李卓明,劉志平,劉培慶.SIRT6通過調節eNOS抑制心肌肥大的機制研究.中山大學學報(醫學科學版),2015,36(3):338-345.