中國(guó)南海矮小短指軟珊瑚(Sinularia nanolobata)的化學(xué)成分研究

　　摘要：運(yùn)用硅膠柱色譜，凝膠柱色譜和高效液相色譜等分離技術(shù)，對(duì)中國(guó)南海西瑁島矮小短指軟珊瑚的丙酮提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離得到 10 個(gè)化合物. 采用多種波譜技術(shù)確定了這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu). 分別鑒定為：羅伯塔特(1)、(1 7R)-loba-8,10,13(15)-triene-17,18-diol(2)、α-生育醌(3)、(1E,3Z,7E,11R,12R)-11-羥基-12-甲氧基-1-異丙基-4,8,12-三甲基-環(huán)十四碳1,3,7-三烯(4)、(+)-(1E,3E,7E,11R,12S)-11,12-epoxy-11,12-dihydrocembrene-C(5)、(1E,3E,7R,8S,11E)-7,8-環(huán)氧-1-異丙基-4,8,12-三甲基-環(huán)十四碳-1,3,11-三烯(6)、24-亞甲基-膽固醇(7)、孕烯醇酮(8)、3β,6α,11-三羥基-24-亞甲基-9,11-斷-5α-膽甾-7-烯-9-酮(9), Sinu grandisterol A(10). 其中化合物 1 為新的異戊烯基欖烷型二萜化合物. 生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物 3 對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶 1B (PTP1B) 的酶活力具有較好的抑制活性，其 IC50 為 4.83±2.35 μΜ，提示該化合物在治療糖尿病和肥胖癥的藥物開發(fā)中具有一定的潛力.

　　關(guān)鍵詞：中國(guó)南海;矮小短指軟珊瑚;異戊烯基欖烷型二萜;PTP1B 抑制活性

　　曾子溶;張夢(mèng)夢(mèng);王鴻;李佳;郭躍偉有機(jī)化學(xué)2021-11-19

　　短指軟珊瑚(Sinularia 屬)的動(dòng)物屬于于腔腸動(dòng)物門珊瑚蟲綱八放珊瑚亞綱軟珊瑚目，主要分布于東非到太平洋的廣闊海域[1]，富含結(jié)構(gòu)新穎和生物活性多樣的萜類和甾體化合物，是海洋天然產(chǎn)物的重要來源. 隨著分離分析技術(shù)的發(fā)展，從 Sinularia 中發(fā)現(xiàn)的化合物的種類也在不斷增加. 其中很多活性顯著的化合物可能成為藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物[2-4] . 最近有報(bào)道稱異戊烯基欖烷型二萜具有較好的抗炎活性[5]，然而該類化合物在海洋軟珊瑚中尚未得到充分的發(fā)掘. 因此，深入研究 Sinularia 中的異戊烯基欖烷型二萜類化學(xué)成分具有重要的研究?jī)r(jià)值. 本課題組長(zhǎng)期致力于海洋生物活性物質(zhì)的研究，已經(jīng)從多種屬的短指軟珊瑚中發(fā)現(xiàn)了大量的活性天然產(chǎn)物，尤其是萜類和甾體類化合物. 前期工作中，本課題組從采自中國(guó)南海的多型短指軟珊瑚(S. polydactyla)中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)新的異戊烯基欖烷型二萜[6] . 為了進(jìn)一步探究該類化合物，豐富其種類和數(shù)量，以尋求結(jié)構(gòu)新穎且具有較好生物活性的化合物，本文對(duì)采自中國(guó)南海西瑁島海域的矮小短指軟珊瑚(S. nanolobata)進(jìn)行了化學(xué)成分研究. 從 S. nanolobata 的丙酮提取物中分離得到了 10 個(gè)化合物(圖 1)，其中化合物 1 是一個(gè)新的異戊烯基欖烷型二萜. PTP1B 是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一員，它在胰島素信號(hào)通路中起負(fù)調(diào)控作用，是一個(gè)新穎的治療糖尿病和肥胖癥的靶點(diǎn). 因此，尋找和開發(fā)高效的 PTP1B 抑制劑具有重要的研究?jī)r(jià)值[7] . 本文對(duì)分離到的 10 個(gè)化合物進(jìn)行了 PTP1B 酶抑制活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)化合物 3 具有較好的 PTP1B 抑制活性，其 IC50 為 4.83±2.35 μΜ. 本文主要報(bào)道新化合物 1 的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定和波譜數(shù)據(jù)，以及分離得到的 10 個(gè)化合物對(duì) PTP1B 抑制活性的篩選結(jié)果.

　　1 結(jié)果與討論

　　1.1 化合物 1 的結(jié)構(gòu)鑒定

　　化合物 1，無色油狀，HR-ESI-MS 顯示 1 的準(zhǔn)分子離子峰 [M+H]+ m/z 319.2630 (計(jì)算值 319.2632)，確定 1 的分子式為 C21H34O2，不飽和度為 5. 綜合分析 13C NMR 和 DEPT 波譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物有 21 個(gè)碳信號(hào)，包括 1 個(gè)羰基(?C 177.5)，2 個(gè) sp2雜化的季碳(?C 140.6, 148.0)， 1個(gè)sp3雜化的季碳(?C39.9)，2個(gè)sp2雜化的叔碳(?C 122.0, 150.6)，3 個(gè) sp3 雜化的叔碳(?C39.2, 47.7, 53.0)，2 個(gè) sp2 雜化的仲碳(?C 109.9, 112.1)，5 個(gè) sp3 雜化的仲碳(?C25.6, 26.9, 33.1, 34.0, 40.1)，4 個(gè)甲基碳信號(hào)，1 個(gè)甲氧基碳信號(hào). 經(jīng)過與文獻(xiàn)中相似化合物的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)化合物 1 與同時(shí)分離的異戊烯基欖烷型二萜 (17R)-loba-8,10,13(15)-triene-17,18-diol (2) [8]的 1H NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)十分相似，區(qū)別主要發(fā)生在側(cè)鏈上. 在 1H1H COSY 譜中，可見質(zhì)子信號(hào) H-15 (?H5.13)、 H-16 (?H1.99, 2.01)、H-17 (?H 1.45, 1.74)、H-18 (?H2.45) 有偶合關(guān)系(圖 2). 在 HMBC 譜(圖 2)中，質(zhì)子信號(hào) H-14 [?H1.60(3H, s)]與碳信號(hào) C-4 (?C47.7)、C-13 (?C 140.6)、C-15 (?C122.0)有相關(guān), H-19 [?H1.15(3H, d, J=7.0Hz]與碳信號(hào) C-17 (?C34.0)、C-18 (?C 39.2)、C-20 (?C 177.5)有相關(guān)，因此，可以確定側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)片段，化合物 1 的平面結(jié)構(gòu)如圖 1 所示. 化合物 1 的立體相對(duì)構(gòu)型是通過 NOESY 以及異戊烯基欖烷骨架的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則[9]確定的, H-2 和 H-4 均為 β-取向, H-7 為 α-取向. 在 1H1H COSY 譜中, H3-14 和 H2-16 NOE 的相關(guān)將 Δ 13,15 定為 E 構(gòu)型，通過 QM-NMR 量子力學(xué)方法計(jì)算兩種可能的構(gòu)型 1a(1R, 2R, 4S, 18R)或 1b(1R, 2R, 4S, 18S). 通過 DP4+，使用具有 6-31G*基集的 B3LYP 泛函，在 DFT 水平上進(jìn)行 幾 何 優(yōu) 化 . 然 后 將 核 磁 共 振 數(shù) 據(jù) 在 PCM/mPW1PW91/6-31+G**水平上計(jì)算，對(duì)實(shí)驗(yàn)與計(jì)算的 1a, 1b 構(gòu)型的 13C NMR 化學(xué)位移進(jìn)行回歸分析，得出了最佳擬合構(gòu)型 1b (圖 3). 最后，將計(jì)算數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，并評(píng)估相應(yīng)的 DP4+概率，1b 構(gòu)型顯示出最高的 DP4+概率(99.88%). 因此推測(cè)出化合物 1 的最佳匹配構(gòu)型為 1b(1R, 2R, 4S, 18S). 同時(shí)確定了 CH3-19 為 β-取向，并將化合物 1 命名為羅伯塔特.

　　化合物 4，無色油狀，為已知化合物，本文首次確定了其絕對(duì)構(gòu)型. 通過對(duì)比具有相似結(jié)構(gòu)單元的已確定絕對(duì)構(gòu)型的化合物的化學(xué)位移[10-13]，對(duì)比碳譜數(shù)據(jù) C-11 (?C69.4)和 C-12 (?C79.3)確定了 11 位的羥基為β取向，12 位的甲基為α-取向、甲氧基為 β-取向.

　　2 結(jié)論

　　通過色譜分離技術(shù)和波譜技術(shù)對(duì)矮小短指軟珊瑚 S. nanolobata 的丙酮提取物進(jìn)行了化學(xué)成分研究，共得到 10個(gè)化合物，這些化合物均為首次從該動(dòng)物中分離得到. 包括 6 個(gè)二萜類化合物和 4 個(gè)甾體化合物. 其中化合物 1 為新化合物，通過經(jīng)驗(yàn)規(guī)則和 DP4+計(jì)算確定了其立體構(gòu)型. 同時(shí)，本文首次確定了化合物 4 的絕對(duì)構(gòu)型. 通過 PTP1B 酶抑制活性實(shí)驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)化合物 3 對(duì) PTP1B 具有較好的酶抑制活性，表明其在治療糖尿病和肥胖癥的藥物發(fā)掘中具有一定的研究?jī)r(jià)值.

　　3 實(shí)驗(yàn)部分

　　Perkin-Elmer 241MC 旋光測(cè)定儀 (PerkinElmer， Fremont，美國(guó));Nicolet iS5 紅外光譜儀 (Thermo Scientific，Waltham，美國(guó));JASCO J-815 圓二色譜儀 (JASCO，日本);Bruker AVANCE III 500 MHz 和 600MHz 核磁共振儀 (Bruker Biospin AG，F(xiàn)ällanden 德國(guó))，以 TMS 信號(hào)作為參照;Agilent G6520 Q-TOF 高分辨質(zhì)譜儀 (Agilent，美國(guó));Agilent 1260 高效液相色譜儀 (Agilent，美國(guó));Agilent Eclipse XDB-C18 半制備色譜柱 (5 µm，9.4 × 250 mm);薄層硅膠板 GF254 和柱色譜用硅膠 (200～300 目，300～400 目，青島海洋化工有限公司，中國(guó));Sephadex LH-20 凝膠 (Amersham Pharmacia Biotech，瑞典);色譜純?cè)噭?(DiKMA，美國(guó))，其他有機(jī)溶劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司. 生物樣品矮小短指軟珊瑚于 2017 年采集于中國(guó)南海西瑁島海域，經(jīng)海南大學(xué)李秀保教授鑒定為 Sinularia nanolobata，標(biāo)本(編號(hào)：17-XD-99)存放于中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所新藥研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.

　　3.1 提取與分離

　　將冷凍的 S. nanolobata (干重量 700g) 切碎，用丙酮超聲提取 5 次，每次 15 min，合并提取液減壓濃縮后，將丙酮浸膏懸浮于 1 L 水中，分別用等體積的乙醚和正丁醇各萃取 3 次，收集萃取液分別減壓濃縮后得到深棕色的乙醚相浸膏 11.3 g 和正丁醇相浸膏 3.3g. 乙醚相浸膏 (5.5 g) 經(jīng)硅膠 (200～300 目)柱色譜，石油醚-乙醚 (100:0→95:5→8:2→7:3→6:4→5:5→0:100) 梯度洗脫，分為 6 個(gè)組分 Frs.A～F. Fr.A 組分 (1.6 g) 先后經(jīng) Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷甲醇 2:1:1) 和硅膠(300-400目)柱色譜 (石油醚-乙醚 100:0→95:5)，被分成 5 個(gè)亞組分 A1～A5, A2 經(jīng)半制備 H PLC，以 100%乙腈等度洗脫(2.5 mL/min)得化合物 1 (4. 8 mg，tR = 16.0 min)和化合物 4 (1.7mg，tR =13.8 mi n). A4 經(jīng)半制備 HPLC，95%乙腈-水等度洗脫(2.5 mL/ min)得化合物 5 (5.1 mg，tR = 16.5 min)和化合物 6 (1 6.7 mg，tR = 17.1 min). Fr.B 組分 (1.6 g) 經(jīng) Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2:1:1) 層析, 得到化合物 7 (384.2mg). Fr.C 組分(348mg) 先后經(jīng) Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2: 1:1) 和硅膠 (300-400 目) 柱色譜 (石油醚-乙醚 12:1→1 0:1→5:1→1:1)，被分為 4 個(gè)亞組分 C1～C4, C2 經(jīng)半制備 HPLC, 以 80%乙腈-水等度洗脫(2.5 mL/min)得化合物 2 (2.8 mg，tR = 14.8 min). Fr.D 組分(703.6mg) 經(jīng) Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2: 1:1) 層析, 得到 6 個(gè)亞組分 D1～D6, D5 再經(jīng)過硅膠(30 0-400 目)柱色譜(石油醚-乙醚 5:1→3:1→1:1,得到化合物 3 (5.5 mg)和化合物 8 (36.0mg). Fr.F 組分(1.2g) 先后經(jīng) Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (石油醚-二氯甲烷甲醇 2:1:1) 層析和 Sephadex HL-20 凝膠柱色譜 (純二氯甲烷) 層析, 得到 4 個(gè)亞組分 F1～F4, F4 經(jīng)半制備 H PLC 80%乙腈-水等度洗脫(2.5 mL/min)得化合物 9 (10 1.4 mg，tR = 7.3 min)和化合物 10 (94.6 mg，tR = 13. 2 min).

　　3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

　　化合物 1 無色油狀物, [α] 20 D +12.3(c 0.10, MeOH); HR-ESI-MS [M+H]+ m/z：319.2630 (Calcd. 319.2632)，分子式 C21H34O2; IR (KBr,cm-1 )vmax: 2970、2928、2859、 1739、1436、1375、1197、1159、907.4、890cm-1 ,其 1H NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)見表 1. 化合物 2～10 為已知化合物, 根據(jù)其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)比對(duì)，將其分別鑒定為(17R)-loba-8,10,13(15)-triene-1 7,18-diol (2) [8]、α-生育醌 (3) [14]、(1E,3Z,7E,11R,12R)- 11-羥基-12-甲氧基-1-異丙基-4,8,12-三甲基-環(huán)十四碳-1, 3,7-三烯(4) [11]、(+)-(1E,3E,7E,11R,12S)-11,12-epoxy-11, 12-dihydrocembrene-C(5) [15]、(1E,3E,7R,8S,11E)-7,8-epo xy-1-isopropyl-4,8,12-trimethyl-cyclotetradeca-1,3,11-trien e (6) [15]、24-亞甲基-膽固醇 (7) [16]、孕烯醇酮 (8) [17]、 3β,6α,11-三羥基-24-亞甲基-9,11-斷-5α-膽甾-7-烯-9-酮 (9) [18], Sinugrandisterol A (10) [19] .

　　3.3 生物活性測(cè)試

　　PTP1B 通過對(duì)胰島素受體或其底物上的酪氨酸殘基去磷酸化作用,對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，本文利用重組 PTP1B 蛋白對(duì)分離的化合物 1～10 進(jìn)行酶活力抑制活性篩選. 將重組的 PTP1B 蛋白(30 nmol/L)與底物對(duì)-硝基苯磷酸鹽(p-NPP,2 mmol/L)以及待測(cè)化合物在 MOPs 緩沖液中 30℃孵育. 通過在 405 nm 下檢測(cè)底物 p-NPP 被去磷酸化后所產(chǎn)生的對(duì)-硝基苯(p-NP)的含量，監(jiān)測(cè) PTP1B 的酶活力. 結(jié)果顯示，化合物 3 對(duì) PTP1B 具有很好的抑制活性，其 IC50 為 4.83±2.35 μΜ. 輔助材料(Supporting information) 化合物 1 的 1D/2D NMR 波譜圖、紅外光譜圖、高分辨質(zhì)譜圖以及計(jì)算方法. 這些材料可以免費(fèi)從本刊網(wǎng)站(http://sioc-journal.cn/) 上下載.