柚皮素對(duì)牙本質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶活性及粘接耐久性的影響

　　[摘要]目的探討柚皮素對(duì)牙本質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶活性及粘接耐久性的影響。方法收集2019年1月至2020年6月就診于深圳市寶安區(qū)婦幼保健院口腔科患者的第三磨牙進(jìn)行研究，第三磨牙由深圳市寶安區(qū)婦幼保健院口腔科提供。將第三磨牙制備成牙本質(zhì)試件及牙本質(zhì)粉，隨機(jī)分為去離子水處理組(空白對(duì)照組)、柚皮素處理組、氯己定處理組。各組分別處理10 mm，將牙本質(zhì)膠原樣本分別置于老化液中15 d，檢測(cè)柚皮素對(duì)膠原干重、羥脯氨酸釋放量、MMPs活性的影響。制作牙本質(zhì)剪切力測(cè)試試件，分別用柚皮素、氯己定、去離子水處理后，檢測(cè)不同組的抗剪切強(qiáng)度。結(jié)果柚皮素和氯己定處理后的牙本質(zhì)膠原的干重丟失比例低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而柚皮素組與氯己定組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。柚皮素組和氯己定組中羥脯氨酸釋放量低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而柚皮素組與氯己定組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。柚皮素組及氯己定組的MMPs總活性均低于空白對(duì)照組，經(jīng)氯己定和去離子水處理的活性值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。柚皮素和氯己定處理后的最大抗剪切強(qiáng)度高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且柚皮素處理后的最大抗剪切強(qiáng)度顯著高于氯己定組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論柚皮素能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性，減少膠原纖維的降解，穩(wěn)定膠原纖維，從而提高牙本質(zhì)粘接耐久性。

　　[關(guān)鍵詞]柚皮素;基質(zhì)金屬蛋白酶活性;粘接耐久性;抗剪切強(qiáng)度

　　基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一組能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)的鈣鋅離子依賴型蛋白酶總稱，其在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，是目前被廣泛研究的膠原酶之一。牙本質(zhì)粘接主要是通過(guò)酸蝕劑或自酸蝕粘接的處理劑，使粘接界面牙本質(zhì)脫礦，膠原纖維暴露，隨后親水性樹(shù)脂粘接劑滲入膠原纖維網(wǎng)，形成微機(jī)械扣鎖作用，連接牙本質(zhì)和樹(shù)脂。然而目前牙本質(zhì)粘接劑的單體均無(wú)法完全滲入至膠原纖維底部，而牙本質(zhì)粘接劑的酸性環(huán)境又能夠?qū)MP酶原激活，從而分解暴露的膠原纖維，對(duì)粘接界面產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致粘接失敗，降低牙本質(zhì)粘接耐久性。因此抑制MMPs的活性能夠有效的增加牙本質(zhì)粘接耐久性[1]。研究顯示，使用柑橘黃烷酮類物質(zhì)能夠改善牙本質(zhì)粘接穩(wěn)定性，提高牙本質(zhì)粘接耐久性[2]。柚皮素具有抗炎、抗氧化等多種生物活性，但目前臨床上鮮有柚皮素是否可以抑制膠原酶活性的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究分析了柚皮素對(duì)牙本質(zhì)MMPs酶活性及粘接耐久性的影響。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料和儀器

　　柚皮素(Sigma，美國(guó));MMPs活性比色法檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因);明膠酶/膠原酶試劑盒(In-vitrogen，美國(guó));羥脯氨酸試劑(南京建成生物科技公司);微量加樣器(Eppendof，德國(guó));多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國(guó));慢速金剛石切割機(jī)(Buehler，美國(guó));分析天平(Mettler Toledo，瑞士);恒溫水浴箱(Shellab，美國(guó));萬(wàn)能材料測(cè)試儀(Shimadzu，日本)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 牙本質(zhì)的膠原樣本制備 收集2019年1月至2020年6月就診于深圳市寶安區(qū)婦幼保健院口腔科患者36顆第三磨牙進(jìn)行研究，第三磨牙由深圳市寶安區(qū)婦幼保健院口腔科提供。將牙齒表面的污垢和軟組織進(jìn)行清除，流水沖洗后去除咬合面釉質(zhì)，充分暴露冠中部牙本質(zhì)，制備成牙本質(zhì)試件，尺寸為7 mm×1.7 mm×0.7 mm，共24個(gè);用100 g/L的H3PO4進(jìn)行脫礦，時(shí)間為24 h，流水沖洗，檢測(cè)牙本質(zhì)試件的完全脫礦情況。

　　1.2.2 牙本質(zhì)的膠原干重檢測(cè) 將牙本質(zhì)膠原樣本置于離心管中，于真空干燥箱中脫水24 h，達(dá)至恒重后對(duì)樣本進(jìn)行稱重并記錄，再浸于去離子水中，隨機(jī)分組為空白組(n=12)：將牙本質(zhì)膠原樣本放置在去離子水中約10 min;柚皮素組(n=12)：將牙本質(zhì)膠原樣本放置在500 μg/ml柚皮素中處理約10 min;氯己定組(n=12)：將牙本質(zhì)膠原樣本放置在2 g/L的氯己定液中處理約10 min。將各組牙本質(zhì)膠原樣本放置在含有1 ml老化液的離心管中，于37℃的恒溫水浴箱中進(jìn)行老化，15 d后進(jìn)行再次離心稱重。

　　1.2.3 羥脯氨酸釋放量檢測(cè) 將老化15 d的牙本質(zhì)膠原樣本取出，將離心管置于離心機(jī)中進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為3000 rpm，時(shí)間為30 min;離心完成后收集上清液，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)羥脯氨酸的含量，波長(zhǎng)設(shè)置為550 nm，每個(gè)樣本檢測(cè)3次，計(jì)算牙本質(zhì)膠原的羥脯氨酸釋放量。

　　1.2.4 基質(zhì)金屬蛋白酶的提取 3種處理組樣本在液氮下碾磨成牙本質(zhì)粉，分別將1 g牙本質(zhì)粉加入至10 ml 10%的磷酸中，置于4℃冰箱中進(jìn)行脫礦，時(shí)間為8 h，再置于超低溫離心機(jī)中進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為3000 rpm，時(shí)間為2 min，棄掉酸蝕液，用5 ml 100mM Tris-HCl對(duì)離心管中剩余的牙本質(zhì)粉進(jìn)行沖洗，再置于離心機(jī)中進(jìn)行離心，棄掉上清液，重復(fù)以上操作3次，加入5 ml十二烷基硫酸鈉溶液，放置在離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速為14 000 rpm，時(shí)間為10 min，提取的上清液為基質(zhì)金屬蛋白酶。

　　1.2.5 酶活性檢測(cè) 用MMPs活性比色法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牙本質(zhì)提取液中的每10 μg總蛋白中的MMPs總活性。

　　1.2.6 剪切試驗(yàn) 環(huán)氧樹(shù)脂包埋離體牙，去除牙釉質(zhì)，暴露冠中部牙本質(zhì)。用600目的砂紙濕潤(rùn)下打磨成平面。粘接面的處理分別是：柚皮素組用500 μg/ml的柚皮素中處理約1 min;氯己定組用2 g/L的氯己定中處理1 min;空白對(duì)照組用去離子水處理1 min。然后按照標(biāo)準(zhǔn)樹(shù)脂粘接、充填流程，完成樣本與復(fù)合樹(shù)脂的粘接。將試件浸泡于37℃蒸餾水中，放置24 h。以0.5 mm/min進(jìn)行加載，記錄界面斷裂時(shí)的最大剪切力。抗剪切強(qiáng)度(MPa)=最大剪切力值(N)/試件粘結(jié)面積(mm2)。

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